Upravil Peter Sarnow, Lekárska fakulta Stanfordskej univerzity, Stanfordská univerzita, Kalifornia, schválené 25. decembra 2020 (preskúmané 25. októbra 2020)
Uvádzame interakciu medzi podjednotkami pri replikácii komplexov koronavírusov a transkripcie, ktoré sú nevyhnutné pre replikáciu a evolučnú ochranu.Poskytli sme dôkaz, že doména NiRAN spojená s nsp12 má nukleozidmonofosfátovú (NMP) transferázovú aktivitu v trans a identifikovali sme nsp9 (proteín viažuci RNA) ako svoj cieľ.NiRAN katalyzuje kovalentné pripojenie NMP skupiny na konzervovaný nsp9 amino koniec v reakcii, ktorá sa spolieha na Mn2+ ióny a priľahlé konzervované Asn zvyšky.Zistilo sa, že aktivita NiRAN a nsp9 NMPylácia sú nevyhnutné pre replikáciu koronavírusu.Údaje nám umožňujú prepojiť túto aktivitu vnoreného vírusového enzýmového markera s predchádzajúcimi pozorovaniami v hypotéze, že iniciácia syntézy RNA v triede RNA vírusov je funkčne a evolučne konzistentná.
RNA-dependentná RNA polymeráza (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae a 12 ďalších čeľadí) je spojená s amino-terminálnou (N-terminálnou) doménou v neštrukturálnom proteíne (nsp) uvoľnenom z polyproteínu, nazývanom NiRAN 1ab sa skladá z hlavnej vírusovej proteázy (Mpro).Predtým bola hlásená vlastná aktivita GMPylácie/UMPylácie arteriálneho vírusu NiRAN-RdRp nsp a navrhovalo sa vytvoriť prechodný prechod na prenos nukleozidmonofosfátu (NMP) do (v súčasnosti neznámeho) vírusu a/alebo vecí biopolymerizácie buniek.Tu ukazujeme, že koronavírus (ľudský koronavírus [HCoV]-229E a ťažký akútny respiračný syndróm koronavírus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) má NMPylačnú aktivitu závislú od Mn2+, ktorá je odvodená od nsp9 prostredníctvom tvorby nsp9 sprostredkovaného Mpro N-koncový lemujúci nsps je proteolyticky uvoľnený, fosforamidát je naviazaný na primárny amín (N3825) na N-konci nsp9.Uridíntrifosfát je preferovaný nukleotid v tejto reakcii, ale adenozíntrifosfát, guanozíntrifosfát a cytidíntrifosfát sú tiež vhodné ko-substráty.Mutačné štúdie s použitím rekombinantných koronavírusových proteínov nsp9 a nsp12 a geneticky upravených mutantov HCoV-229E určili zvyšky potrebné na NiRAN-sprostredkovanú nsp9 NMPyláciu a replikáciu vírusu v bunkovej kultúre.Údaje potvrdili predpoveď zvyškov aktívneho miesta NiRAN a určili dôležitú úlohu zvyškov nsp9 N3826 pri nsp9 NMPylácii a replikácii vírusu in vitro.Tento zvyšok je súčasťou konzervovanej N-koncovej tripeptidovej sekvencie NNE a ukázalo sa, že je jediným invariantným zvyškom nsp9 a jeho homológov v rodine koronavírusov.Táto štúdia poskytuje solídny základ pre funkčnú štúdiu NMPylačnej aktivity iných vnorených vírusov a navrhuje možné ciele pre vývoj antivírusových liekov.
Vírus RNA s pozitívnym reťazcom Nidovirales infikuje rôzne stavovce a bezstavovce (1, 2).Objednávka v súčasnosti zahŕňa 14 rodín (3), z ktorých rodina koronavírusov bola za posledných 20 rokov dôkladne študovaná.V tom čase sa zo zvieracích hostiteľov objavili tri zoonotické koronavírusy a spôsobili rozsiahle prepuknutia ťažkých respiračných infekcií u ľudí.Vrátane pretrvávajúcich pandémií spôsobených ťažkými akútnymi infekčnými ochoreniami.Respiračný syndróm Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovírusy zdieľajú spoločnú organizáciu genómu a podjednotka replikačne-transkripčného komplexu viazaného na membránu (RTC) je kódovaná v 5-a²-terminálnych dvoch tretinách a hlavnej štruktúrnej podjednotke vírusovej častice, ako aj niektoré doplnky. .Proteín, kódovaný v 3?² koncovej tretine genómu (1).Okrem jednej rodiny planárnych vírusov (Monoviridae) (8), všetky vnorené vírusy kódujú RTC podjednotky v dvoch veľkých otvorených čítacích rámcoch (ORF) ORF1a a ORF1b, ktoré sú preložené z genómovej RNA z.ORF1a kóduje polyproteín (pp) 1a a ORF1a a ORF1b spoločne kódujú pp1ab.Za všeobecnej účasti hlavnej proteázy (Mpro) kódovanej ORF1a sa pp1a aj pp1ab proteolyticky spracovávajú na rôzne neštrukturálne proteíny (nsps), známe tiež ako 3CLpro, pretože majú homológiu s 3Cpro pikornavírusu ( 9).Predpokladá sa, že tieto nsps sú zostavené do veľkého dynamického RTC, katalyzujú syntézu genómovej RNA (replikácia) a súboru subgenómovej RNA (transkripcia) a používajú sa na koordináciu expresie ORF umiestneného po smere od ORF1b (10? 12).
Jadro RTC zahŕňa RNA-dependentnú RNA polymerázu (RdRp) (13), helikázu superrodiny 1 (HEL1) (14, 15) a niekoľko enzýmov na spracovanie RNA, ktoré sú kódované hlavne v ORF1b a v rodine koronavírusov Obsahuje nsp12-nsp16 a nsp9-nsp12 v čeľade Arterioviridae (pozri odkaz 10ââ 12).RdRp a HEL1 predstavujú dve (jedna pätina) konzervované domény vírusu vtáčieho hniezda a majú homológiu medzi inými RNA vírusmi.Predpokladá sa, že replikáza jadra je podporovaná ďalšími podjednotkami, vrátane niekoľkých malých nsps uvoľnených z karboxy-terminálnej (C-terminálnej) oblasti ppla, downstream od Mpro (koronavírus nsp5 a arteriálny vírus nsp4, v danom poradí).Majú obmedzenú rodinnú ochranu a rôzne aktivity (prehľad v odkaze 10 – 12).
Relatívne nedávno bola doména s jedinečnými charakteristikami sekvenčného motívu nájdená na amino-konci (N-koniec) susediacom s RdRp vo všetkých vnorených vírusoch, ale v žiadnom inom RNA víruse (16).Na základe svojej polohy a aktivity nukleotidovej transferázy (nukleozidmonofosfát [NMP] transferáza) sa táto doména nazýva NiRAN (nukleotidová transferáza súvisiaca s Nestvirus RdRp).Dvojdoménová kombinácia NiRAN-RdRp tvorí nsp12 v rodine Coronaviridae a nsp9 v rodine Arterioviridae a v iných nestoviridae sa očakáva, že NiRAN-RdRp sa uvoľní ako nezávislý nsp z vírusového polyproteínu.V koronavíruse doména NiRAN obsahuje a1/450 zvyškov a je pripojená k C-koncovej RdRp doméne cez spojovaciu oblasť (16-19).Vo víruse arteritídy koní (EAV) (Arteriviridae) vykazuje rekombinantný nsp9 iónovo závislú (vlastnú) UMPyláciu a GMPyláciu Mn2+, ktoré závisia od troch konzervovaných sekvenčných báz v nestovíruse, AN, BN a CN zvyškov v sekvencii.Kde N znamená NiRAN) (16).N-koncové lemovanie týchto motívov je menej konzervatívny motív preAN.Niektoré z týchto zvyškov sú tiež konzervované vo vzdialene príbuzných proteínkinázach, kde sa ukázalo, že sa podieľajú na väzbe nukleozidtrifosfátu (NTP) a katalytickej aktivite (20, 21).V súlade s týmto pozorovaním je možné niekoľko kľúčových zvyškov aktívnych miest v pseudokináze SelO z Pseudomonas syringae zostaviť s nedávno publikovaným superkomplexom SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Konzervované zvyšky NiRAN koronavírusu superponované v elektrónovej mikroštruktúre.Rekombinantný proteín (17).Špekuluje sa, že zdokumentovaná (vlastná) U/GMPylácia vytvorí prechodný stav na prenos NMP na (v súčasnosti neznámy) substrát (16) a štrukturálna podobnosť medzi NiRAN a proteínkinázou (17, 19) je hypotéza, že NiRAN modifikuje iné proteíny.
Mnoho funkcií, vrátane jeho jedinečného a jedinečného systematického spojenia s vnorenými vírusmi a genetickej separácie od RdRp, robí NiRAN rozumným kľúčovým regulačným enzýmom pre vnorené vírusy, čo je rozhodujúce pre ich vznik a identitu.Predtým boli nazývané tri možné funkcie zahŕňajúce NiRAN na reguláciu genómovej / subgenomickej translácie alebo replikácie / transkripcie.Keď vezmeme do úvahy vzácne a neúplné údaje, ktoré sú v tom čase k dispozícii, každá funkcia má svoje výhody a nevýhody (16).V tomto výskume sa snažíme skombinovať biochemické a reverzné genetické štúdie koronavírusov reprezentujúcich dva rody a zasadiť naše zistenia do evolučného pozadia prirodzenej mutácie rodiny koronavírusov, aby sme nahliadli do tejto tajomnej ríše.Uvádzame hlavné pokroky v chápaní NiRAN prostredníctvom identifikácie prirodzených cieľov v RTC, čo (medzi tromi dostupnými hypotézami) prispieva k úlohe tejto domény pri iniciácii syntézy vnorenej vírusovej RNA.Tento výskum tiež otvára možnosti pre ďalšie úlohy NiRAN na rozhraní hostiteľa vírusu.
Aby sme charakterizovali enzymatické vlastnosti NiRAN domény súvisiacej s koronavírusom nsp12, vytvorili sme rekombinantnú formu ľudského koronavírusu 229E (HCoV-229E) nsp12 v E. coli s His6 tagom na C-konci a spojili sme proteín s [a32-P] Inkubujte spolu s NTP v prítomnosti MnCl2, ako je opísané v časti Materiály a metódy.Analýza reakčného produktu ukázala prítomnosť rádioaktívne značeného proteínu migrujúceho spolu s nsp12 (106 kDa), čo naznačuje, že koronavírus nsp12 katalyzuje tvorbu kovalentných proteín-NMP aduktov, prednostne vytvorených s uridínmonofosfátom (UMP) (obrázok 1A) a B).Kvantitatívna analýza ukázala, že v porovnaní s inými nukleotidmi sa intenzita signálu inkorporácie UMP zvýšila 2 až 3-krát (obrázok 1C).Tieto údaje sú v súlade s predpovedanou aktivitou NMP transferázy domény NiRAN koronavírusu (16), ale naznačujú, že preferencie nukleotidov domény NiRAN koronavírusu a arteriálneho vírusu sú odlišné.
Samo-NMPylačná aktivita HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nspl2-His6 (106 kDa) sa inkuboval s označeným [a-32P] NTP v prítomnosti 6 mM MnCl2 počas 30 minút (podrobnosti nájdete v časti Materiály a metódy).Reakčné produkty boli oddelené pomocou SDS-PAGE a zafarbené Coomassie brilantnou modrou.(B) Rádioaktívne značený proteín je vizualizovaný fosforovým zobrazením.Polohy nsp12-His6 a markerov molekulovej hmotnosti proteínu (v kilodaltonoch) sú uvedené v A a B. (C) Intenzita rádioaktívneho signálu (priemer ± SEM) bola stanovená z troch nezávislých experimentov.*P≤0,05.Sila signálu (v percentách) súvisí s UTP.
Hoci sa ukázalo, že enzýmové aktivity súvisiace s NiRAN sú nevyhnutné pre replikáciu EAV a SARS-CoV v bunkovej kultúre (16), špecifická funkcia NiRAN a potenciálne ciele ešte neboli stanovené.Nedávno oznámená štrukturálna podobnosť medzi NiRAN a rodinou proteínov so záhybmi podobnými proteínkináze (17, 22) nás podnietila otestovať hypotézu, že NiRAN katalyzuje NMPyláciu iných proteínov.Vytvorili sme súbor potenciálnych homológnych cieľov, vrátane neštrukturálnych proteínov kódovaných HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), z ktorých každý obsahuje C-terminálnu značku His6 (príloha SI, tabuľka S1), a inkubujte tieto proteíny s [a32-P]uridíntrifosfátom ([a32-P]UTP) v prítomnosti alebo neprítomnosti nsp12.Hovädzí sérový albumín a fúzny proteín MBP-LacZa produkovaný v E. coli slúžili ako kontroly (obrázok 2A, dráhy 1 až 7).Rádioaktívne značený proteín sa analyzoval elektroforézou na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) a autorádiografiou a zistilo sa, že v reakcii obsahujúcej nsp12 a nsp9 bol silný rádioaktívny signál.Poloha signálu zodpovedá molekulovej hmotnosti nsp9, čo naznačuje UMPyláciu nsp9 sprostredkovanú nsp12 (obrázok 2B, stopa 7).Nezistilo sa, že by boli UMPylované žiadne iné testované proteíny, čo nás viedlo k záveru, že nsp9 je špecifický substrát nsp12.V súlade s údajmi o vlastnej NMPylácii zobrazenými na obrázku 1 je nsp12 schopný preniesť všetky štyri NMP na nsp9, hoci účinnosť je iná, UMP> adenozínmonofosfát (AMP)> guanozínmonofosfát (GMP)> cytidínmonofosfát (CMP)) ( Obrázok).3A a B).Za podmienok použitých v tomto teste (skrátiť reakčný a expozičný čas, znížiť koncentráciu nsp12; materiály a metódy) nebolo možné detegovať samo-NMPyláciu nsp12 (porovnaj obrázok 2B, dráhu 7 a obrázok 1B), čo sa ukázala ako účinná (a niekoľko kôl) UMP sa presunula z nsp12 na nsp9.Aktivita UMP transferázy vyžaduje prítomnosť Mn2+ iónov, ako je znázornené na obrázku 3C, zatiaľ čo len minimálna aktivita UMP transferázy bola pozorovaná v prítomnosti Mg2+ a žiadna aktivita v prítomnosti ďalších dvoch testovaných dvojmocných katiónov.Podobné údaje sa získali v NMPylačných testoch obsahujúcich cytidíntrifosfát (CTP), guanozíntrifosfát (GTP) a adenozíntrifosfát (ATP) (príloha SI, obrázok S1).
HCoV-229E nsp12-sprostredkovaná UMPylácia nsp9.Séria proteínových substrátov (vrátane hovädzieho sérového albumínu, MBP-lacZα a série HCoV-229E nsps značených C-koncovým His6 kódovaným ORF1a) sa použila na vyhodnotenie UMPylačnej aktivity sprostredkovanej HCoV-229E nsp12-His6⁺ bielkoviny.Inkubujte proteín s [a-32P] UTP počas 10 minút v neprítomnosti (A) alebo prítomnosti (B) nsp12, ako je opísané v materiáloch a metódach.V hornej časti A a B je zobrazený SDS-polyakrylamidový gél zafarbený Coomassie Brilliant Blue a v spodnej časti A a B sú zobrazené zodpovedajúce autorádiogramy.Poloha markera molekulovej hmotnosti proteínu (v kilodaltonoch) je uvedená vľavo.Je tiež uvedená poloha nsp12-His6 (B, hore) a rádioaktívny signál pozorovaný počas inkubácie nsp12-His6 s nsp9-His6 (B, dráha 7), čo naznačuje, že [a-32P]UMP na nsp9-His6 (12,9 kDa), čo nebolo pozorované pre iné testované proteíny.
HCoV-229E NiRAN-sprostredkovaná biochemická a virologická charakterizácia nsp9 NMPylácie.(A a B) Úloha nukleotidového ko-substrátu použitého v reakcii.Nsp12-His6 a nsp9-His6 sa zmiešajú a inkubujú v prítomnosti rôznych [a-32P] NTP v štandardnom teste NMPylácie.(A, hore) Coomassie zafarbený nsp9-His6 oddelený SDS-PAGE.(A, dole) Autorádiograf tej istej oblasti gélu.(B) Relatívna aktivita (priemer ± SEM) v prítomnosti označeného nukleotidového kofaktora sa stanoví z troch nezávislých experimentov.*P≤0,05.(C) Úloha kovových iónov.Je znázornený štandardný NMPylačný test v prítomnosti [a-32P] UTP a rôznych kovových iónov, každý s koncentráciou 1 mM.V hornej časti C je zobrazený nsp9-His6 zafarbený Coomassie a v dolnej časti C je zobrazená zodpovedajúca autorádiografia.Veľkosť označeného proteínu (v kilodaltonoch) je znázornená naľavo od A a C. (D) Mutantná forma HCoV-229E nsp12-His6 nesúca špecifikovanú aminokyselinovú substitúciu je v [a-32P]UTP, ako je opísané v materiáloch a metódach.Rádioaktívne značený nsp9-His6 produkovaný v NMPylačnej reakcii sa deteguje fosforylačným zobrazením (D, hore).Relatívna aktivita v porovnaní s proteínom divokého typu (wt) je znázornená v D a spodná časť sa berie ako priemer (± SEM) z troch nezávislých experimentov.Hviezdičky označujú substitúcie nekonzervovaných zvyškov.(E) Titer vírusu v supernatante kultúry buniek pl získaných 24 hodín po infekcii sa stanovil testom plakov.Sú označené kodónové substitúcie v doméne NiRAN upraveného mutantu HCoV-229E (číslovanie zvyškov je založené na ich polohe v pp1ab).Ako kontrola sa použil replikačne deficitný mutant aktívneho miesta RdRp nsp12_DD4823/4AA.
Aby sme získali hlbšie pochopenie aktívneho miesta NiRAN a určili zvyšky súvisiace s aktivitou nsp9-špecifickej NMP transferázy, vykonali sme analýzu mutácií, v ktorej sme nahradili konzervatívne zvyšky v motívoch NiRAN AN, BN a CN ( 16) Je to Ala (príloha SI, obrázok S2).Okrem toho sa v dvoch prípadoch hodnotil vplyv konzervatívnych substitúcií Arg-to-Lys alebo Lys-to-Arg.Ako (negatívna) kontrola sú zvyšky, ktoré nie sú alebo sú menej konzervované v doméne NiRAN koronavírusov a iných vnorených vírusov, nahradené Ala. Nahradenie K4116A (v motíve preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motív BN) a D4280A (CN) výrazne znižuje alebo dokonca eliminuje nsp9 NMPyláciu prostredníctvom nsp12, zatiaľ čo proteíny s konzervatívnymi substitúciami (R4178K), K4116R) si zachovávajú 60 % a 80 % svojej aktivity, čo naznačuje, že uvoľnenie obmedzení na ich príslušnej strane reťazcov je fyzikálno-chemicky citlivý (obrázok 3D).Nahradenie niekoľkých ďalších konzervovaných zvyškov E4145A, D4273A, F4281A a D4283A je oveľa menej škodlivé a nsp9 UMPylácia je len mierne znížená.Podobné výsledky sa získali v nsp9 NMPylačných reakciách zahŕňajúcich iné NTP (obrázok 3D a príloha SI, obrázok S3), čo potvrdzuje, že pozorované účinky na špecifické substitúcie aminokyselín sú nezávislé od typu použitého nukleotidového ko-substrátu.Ďalej sme testovali možný vplyv týchto nsp12 substitúcií na replikáciu koronavírusov v bunkovej kultúre.Na tento účel sme použili vhodné geneticky upravené templáty komplementárnej DNA (cDNA) klonované v rekombinantnom víruse vakcínie (23, 24) na transkripciu 5-7 buniek.Titrácia potomstva infekčného vírusu produkovaného v týchto bunkách ukázala, že väčšina mutantov HCoV-229E NiRAN nebola uskutočniteľná (obrázok 3E).Skupina neživotaschopných vírusových mutantov zahŕňa alternatívy, o ktorých sa ukázalo, že eliminujú alebo významne znižujú aktivitu NMP transferázy in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), existujú však dve ďalšie alternatívy (K4116R, E4145A) 80 % rezervovaných?Ich in vitro NMPylačná aktivita naznačuje, že sú zahrnuté ďalšie obmedzenia.Podobne dve ďalšie mutácie (R4178K, F4281A), ktoré spôsobili mierny pokles in vitro NMPylačnej aktivity NiRAN, produkovali živé vírusy, tieto vírusy však replikáciou významne znížili titre.V súlade s údajmi o aktivite in vitro zobrazenými na obrázku 3D, nahradenie štyroch ďalších zvyškov, ktoré nie sú konzervované v koronavíruse a/alebo iných vnorených vírusoch (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), produkovalo životaschopné vírusy. mierne znížený titer v porovnaní s vírusom divokého typu (obrázok 3E).
Aby bolo možné študovať, či aktivita NMP transferázy sprostredkovaná NiRAN závisí od aktívnej domény RdRp, dva konzervované zvyšky Asp zapojené do koordinácie iónov dvojmocných kovov (11) v motíve C RdRp boli nahradené Ala. Výsledný proteín nsp12_DD4823/4AA si zachováva jeho nsp9 NMPylačná aktivita, čo naznačuje, že in vitro nsp9 NMPylačná aktivita sprostredkovaná nsp12 nevyžaduje polymerázovú aktivitu (príloha SI, obrázok S4).
Po stanovení aktivity NMP transferázy špecifickej pre nsp9 pre nsp12 sme sa pokúsili charakterizovať adukt NMP-nsp9 hmotnostnou spektrometriou (MS).Kompletné proteínové hmotnostné spektrum rekombinantného HCoV-229E nsp9 ukázalo vrchol pri 12 045 Da (obrázok 4A).Pridanie nsp12 nezmenilo kvalitu nsp9, čo naznačuje, že nsp12 a nsp9 by za použitých podmienok (denaturácia) nevytvorili stabilný komplex (obrázok 4A).V prítomnosti UTP a GTP ukázalo meranie hmotnosti reakcie obsahujúcej nsp9 a nsp12, že proteínová hmotnosť UTP sa posunula o 306 Da a proteínová hmotnosť GTP sa posunula o 345 Da, čo naznačuje, že každá molekula nsp9 sa viaže na UMP alebo GMP. (Obrázok 4) C a D).Predpokladá sa, že energia potrebná na nsp9 NMPyláciu sprostredkovanú NiRAN pochádza z hydrolýzy NTP a uvoľňovania pyrofosfátu.Aj keď sa v tejto reakcii použil 10-násobný molárny nadbytok nsp9 (cieľ) ako nsp12 (enzým), pozorovala sa takmer úplná NMPylácia nsp9, čo naznačuje, že interakcia medzi nsp12 a nsp9 je krátkodobá a nsp12 môže NMPylovať viac nsp9 in vitro molekula.
Jednoduchá NMPylácia nsp9 v prítomnosti nsp12 a UTP alebo GTP.Ukázané je dekonvoluované kompletné proteínové hmotnostné spektrum HCoV-229E nsp9 (SI príloha, tabuľka S1) (AD).(A) samotný nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 v prítomnosti UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 v prítomnosti GTP.
Na určenie zvyškov nsp9 UMPylovaných pomocou nsp12 sa nsp9-UMP štiepil trypsínom.Výsledné peptidy boli oddelené nano-vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) a analyzované tandemovou hmotnostnou spektrometriou (MS/MS) online.Analýza údajov pomocou softvéru Byonic (Protein Metrics) ukázala UMPyláciu N-koncovej aminokyseliny.Toto sa potvrdí manuálne.Tandemové hmotnostné spektrum prekurzorového peptidu [UMP]NNEIMPGK (SI príloha, obrázok S5A) odhalilo fragment pri 421 m/z, čo naznačuje, že UMP sa viaže na zvyšok 1 nsp9.
Na N-konci nsp9 je Asn konzervovaný medzi členmi Orthocoronavirinae (príloha SI, obrázok S6).Aj keď sa domnievame, že N-koncový primárny amínový dusík je najpravdepodobnejším akceptorom pre UMP, rozhodli sme sa získať ďalší dôkaz o väzbe NMP na N-konci.Z tohto dôvodu sa neNMPylovaný a NMPylovaný N-koncový peptid nsp9 purifikovaný pomocou HPLC odvodil v prítomnosti acetónu a kyanoborohydridu sodného.Za týchto podmienok môžu byť propylom (25) modifikované iba voľné primárne amíny.N-koncový peptid odvodený od nsp9 so sekvenciou NNEIMPGK obsahuje dva primárne amíny, jeden na N-konci Asn a druhý na bočnom reťazci Lys na C-konci.Preto môžu byť propylové skupiny zavedené na oboch koncoch.Extrahované iónové chromatogramy neNMPylovaných peptidov sú uvedené v prílohe SI, obrázok S5B.Ako sa očakávalo, možno identifikovať N-terminálne a C-terminálne (mono)propylované (SI príloha, obrázok S5B, horný pruh) a dipropylované peptidy (SI príloha, obrázok S5B, spodný pruh).Tento vzor sa mení s použitím NMPylovaného N-koncového peptidu nsp9.V tomto prípade je možné identifikovať iba C-koncové propylované peptidy, ale N-koncové propylované peptidy a dipropylované peptidy nie sú identifikované (príloha SI, obrázok S5C), čo naznačuje, že UMP bol prenesený na N-koncový primárny amín, aby sa tomu zabránilo skupiny od vykonávania zmien.
Ďalej nahradíme (s Ala alebo Ser) alebo vymažeme konzervované zvyšky na N-konci nsp9, aby sme definovali cielene špecifické obmedzenia.Na základe našich údajov MS, ktoré ukazujú, že NiRAN tvorí adukt nsp9-NMP s primárnym amínom N-koncového zvyšku nsp9, sme predpokladali, že NMPylácia nsp9 vyžaduje vírusovú hlavnú proteázu (Mpro, nsp5), aby uvoľnila N-koniec nsp9 z jeho polyproteínový prekurzor.Na testovanie tejto hypotézy sme vytvorili prekurzorový proteín nsp7-11 obsahujúci nsp9 v E. coli a vykonali sme štandardný NMPylačný test v prítomnosti [a-32P] UTP (materiály a metódy).Ako je znázornené na obrázku 5A (dráha 3), nerozrezaný prekurzor nsp7-11 nie je rádioaktívne označený nsp12.Na rozdiel od toho, ak je nsp7-11 štiepený rekombinantným nsp5, aby sa uvoľnil nsp9 (a iné nsps) z prekurzora, deteguje sa rádioaktívne značený proteín, ktorý migruje s nsp9, čo potvrdzuje náš záver, že NiRAN a N-selektívna tvorba kovalentných nsp9-NMP aduktov .Terminálny primárny amín N-terminálneho Asn (pozícia 3825 v ppla/pp1ab).Tento záver podporujú aj experimenty využívajúce konštrukt nsp9, ktorý obsahuje jeden alebo dva ďalšie zvyšky na N-konci.V oboch prípadoch bola UMPylácia nsp9 sprostredkovaná NiRAN zrušená (príloha SI, obrázok S7).Ďalej sme produkovali proteín s jedným alebo dvoma zvyškami Asn deletovanými z peptidovej sekvencie 3825-NNEIMPK-3832 na N-konci nsp9.V oboch prípadoch bola nsp9 UMPylácia úplne blokovaná (obrázok 5B), čo poskytuje ďalší dôkaz, že skutočný N-koniec nsp9 pôsobí ako NMP receptor.
Proteolytické spracovanie nsp9 a úloha N-terminálnych zvyškov v UMPylácii sprostredkovanej nsp12.(A) nsp9 UMPylácia vyžaduje voľný nsp9 N-koniec.Nsp7-11-His6 sa predinkubuje pri 30 °C v NMPylačnom detekčnom pufri obsahujúcom UTP v prítomnosti alebo neprítomnosti rekombinantného Mpro (nsp5-His6).Po 3 hodinách začnite NMPylačný test pridaním nsp12-His6, ako je opísané v časti Materiály a metódy.Reakcia obsahujúca nsp5-His6 (dráha 1) a nsp9-His6 (dráha 2) sa použila ako kontrola.Po 10 minútach sa reakcia ukončila a reakčná zmes sa rozdelila pomocou SDS-PAGE.Proteín bol zafarbený Coomassie Brilliant Blue (A, hore).Prekurzor Nsp7-11-His6 a spracovaný produkt, ktorý je výsledkom štiepenia sprostredkovaného nsp5-His6, sú zobrazené vpravo.Upozorňujeme (kvôli ich malej veľkosti), že nsp7 a nsp11-His6 nie sú v tomto géli detekovateľné a reakcia je doplnená o nsp5-His6 (dráhy 1 a 4; poloha nsp5-His6 je označená plným kruhom) alebo nsp9-His6 (dráha 2) obsahuje malé množstvo MBP (označené prázdnymi krúžkami) ako zvyškové nečistoty, pretože sú exprimované ako MBP fúzne proteíny (SI príloha, tabuľka S1).(B) Variantu Nsp9-His6 chýba jeden alebo dva N-terminálne zvyšky Asn (číslovanie zvyškov podľa polohy v ppla/pp1ab) a je purifikovaný a inkubovaný s nsp12-His6 a [a-32P] UTP.B, SDS-PAGE zafarbená Coomassie je zobrazená hore, B, zodpovedajúci autorádiograf je zobrazený dole.Poloha markera molekulovej hmotnosti (v kilodaltonoch) je znázornená vľavo.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-koncové konzervované zvyšky boli nahradené Ala alebo Ser a rovnaké množstvo proteínu bolo použité v nsp12-His6 sprostredkovanej UMPylačnej reakcii.Reakčné produkty sa oddelili pomocou SDS-PAGE a zafarbili sa Coomassie Brilliant Blue (C, hore) a rádioaktívne značený nsp9-His6 sa detegoval fosforescenčným zobrazovaním (C, stred).Použitím proteínu divokého typu (wt) ako referencie (nastavené na 100 %) bola vypočítaná relatívna NMPylačná aktivita (priemer ± SEM) z troch nezávislých experimentov.(D) Titre vírusu v supernatante bunkovej kultúry pl buniek Huh-7 infikovaných bunkami Huh-7 divokého typu HCoV-229E a mutantov nesúcich určené substitúcie aminokyselín v nsp9 sa stanovili plakovým testom.Replikačne deficitný RdRp motív C dvojitý mutant DD4823/4AA sa použil ako negatívna kontrola.
N-koniec nsp9 (najmä polohy 1, 2, 3 a 6) je medzi členmi podčeľade Orthocoronavirinae veľmi konzervovaný (príloha SI, obrázok S6).Aby sa študovala možná úloha týchto zvyškov v nsp9 NMPylácii sprostredkovanej nsp12, dva po sebe idúce zvyšky Asn na N-konci nsp9 boli nahradené Ala alebo Ser (samotnými alebo v kombinácii).V porovnaní s nsp9 divokého typu viedlo nahradenie N3825 Ala alebo Ser k viac ako dvojnásobnému zníženiu UMPylácie sprostredkovanej nsp12 (obrázok 5C).V súlade s naším záverom, že NMPylácia sa vyskytuje na N-koncovom primárnom amíne namiesto bočného reťazca N-koncového zvyšku, sme pozorovali významnú zvyškovú NMPyláciu nahradením N3825A a N3825S.Je zaujímavé, že ak je druhý Asn nahradený Ala alebo Ser, nsp9 UMPylácia sa zníži výraznejšie (viac ako 10-krát), zatiaľ čo nahradenie Ala v pozíciách 3, 4 a 6 má len mierny vplyv na nsp9 UMPyláciu (obrázok 2 ).5C).Podobné výsledky sa získali pri použití ATP, CTP alebo GTP (príloha SI, obrázok S8).Súhrnne tieto údaje naznačujú kľúčovú úlohu N2826 (pozícia 2 v nsp9) v nsp9 NMPylácii.
Aby sme získali ďalší dôkaz o funkčnej korelácii medzi N-koncom nsp9 a NMPyláciou, vykonali sme viacnásobné zarovnanie sekvencií (MSA) sekvencie nsp9 z rodiny koronavírusov (v rozmedzí 104 až 113 zvyškov) (príloha SI, obrázok S6).Celkovo sa v 47 (známych a predpokladaných) druhoch 5 rodov podčeľade Orthocoronavirinae, ktoré infikujú rôznych hostiteľov cicavcov, vtákov a plazov, zistilo, že celkovo len 8 zvyškov je invariantných.Najrozsiahlejšie zmeny, vrátane delécií a inzercií, boli pozorované v cykloch medzi prvkami sekundárnej štruktúry nsp9, ako bolo určené predchádzajúcimi štrukturálnymi štúdiami (26 - 28).Päť invariantných zvyškov sa našlo v p reťazci a a helixe C-terminálnej časti nsp9.Tri invariantné zvyšky tvoria NNE motív N-konca nsp9.Ukazuje sa, že druhý Asn tohto motívu je jediným invariantným zvyškom, ktorý je tiež zdieľaný hypotetickým nsp9 vzdialene príbuzného žabieho koronavírusu a predstavuje druh Microhyla letovirus 1 v podčeľade Letovirinae of Alphaletovirus.Konzerváciu zvyškov v sekundárnych štruktúrnych prvkoch nsp9 možno racionalizovať štrukturálnymi úvahami, aby sa zachovali vlastnosti skladania alebo známych väzbových vlastností RNA.Zdá sa však, že táto úvaha neplatí pre zachovanie NNE a pred touto štúdiou bola povaha obmedzení, ktoré obmedzujú variáciu tripeptidovej sekvencie, úplne zakrytá.
Aby sme určili dôležitosť nsp9-NMPylácie a konzervácie NNE pri replikácii koronavírusu, vytvorili sme mutanty HCoV-229E, ktoré nesú jednoduché alebo dvojité substitúcie nsp9 N-terminálnych zvyškov, čo naznačuje, že nsp9 NMPylácia je škodlivá in vitro.Skôr ako začneme, pokúsime sa odpovedať na otázku, či tieto substitúcie (v blízkosti miesta štiepenia nsp8|9) ovplyvňujú proteolytické spracovanie C-terminálnej oblasti pp1a.Sada nsp7-11 polyproteínových konštruktov obsahujúcich zodpovedajúce substitúcie na N-konci nsp9 bola produkovaná v E. coli a štiepená rekombinantným Mpro.Proteolytické štiepenie štyroch miest (vrátane hraničného miesta nsp9) nie je významne ovplyvnené žiadnymi zavedenými substitúciami (príloha SI, obrázok S9), s výnimkou štrukturálnych zmien v týchto proteínoch, ktoré interferujú so štiepením nsp8|9 sprostredkovaným Mpro (alebo iným) webovej stránky.
Bunky Huh-7 boli transfekované RNA HCoV-229E s genómovou dĺžkou, ktorá kóduje substitúcie Ala alebo Ser v konzervovaných tripeptidoch NNE (N3825, N3826 a E3827) na N-konci nsp9, čo ukazuje, že väčšina mutácií je smrteľná.Dokázali sme zachrániť vírus nahradením Ser alebo Ala N-terminálneho Asn (N2835A alebo N2835S), ale nepodarilo sa nám obnoviť vírus s inými jednoduchými a dvojitými mutáciami v sekvencii NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (obrázok 5D).
Tieto výsledky naznačujú, že replikácia koronavírusov v tkanivovej kultúre je obmedzená (rovnaká alebo podobná), čo obmedzuje prirodzenú mutáciu miest NMPylácie nsp9 v tele a podporuje kľúčovú úlohu tejto reakcie v životnom cykle koronavírusov.
V poslednej sérii experimentov sme produkovali C-koncový His6 značený SARS-CoV-2 nsp12 a nsp9 a dve mutantné formy nsp12 v E. coli.Zvyšky aktívneho miesta v doménach NiRAN a RdRp boli namiesto toho použité Ala (obrázok 6A a príloha SI, tabuľka S2).K4465 v SARS-CoV-2 nsp12 zodpovedá K4135 v HCoV-229E (príloha SI, obrázok S2), ktorý sa ukázal ako potrebný pre aktivitu NiRAN a replikáciu HCoV-229E (obrázok 3D a E).Tento zvyšok tiež zodpovedá zvyšku arteriálneho vírusu EAV nsp9 K94, o ktorom sa predtým ukázalo, že je nevyhnutný pre samo-UMPyláciu/samo-GMPyláciu NiRAN (16).Ako je znázornené na obrázku 6B, SARS-CoV-2 nsp12 má aktivitu UMP transferázy s použitím nsp9 ako substrátu, zatiaľ čo mutant aktívneho miesta nsp12_K4465A je neaktívny.Dvojitá substitúcia v SDD charakteristickej sekvencii RdRp motívu C neovplyvňuje aktivitu UMP transferázy (obrázok 6B), čo naznačuje, že aktivita RdRp nemá žiadny priamy účinok na nsp9 UMPyláciu.Podobné údaje sa získali pomocou CTP, GTP a ATP (príloha SI, obrázok S10).V súhrne tieto údaje naznačujú, že nsp9 NMPylácia sprostredkovaná NiRAN má konzervatívnu aktivitu v koronavírusoch predstavujúcich rôzne rody podrodiny ortokoronavírusov.
NMPylácia nsp9 sprostredkovaná nsp12 SARS-CoV-2.(A) SDS-polyakrylamidový gél farbený Coomassie ukazujúci rekombinantný proteín použitý v NMPylačnom teste.Ako kontrola sa použil mutantný proteín so substitúciou aktívneho miesta v doméne NiRAN (K4465A) a doméne RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Číslovanie zvyškov je založené na pozícii v pp1ab.(B) Autorádiografia detekcie UMPylácie s použitím nsp9-His6 a [a-32P]UTP ako substrátu nsp12-His6 (divoký typ [wt] a mutant).Molekulová hmotnosť (v kilodaltonoch) značeného proteínu je uvedená vľavo.
Domény NiRAN sú vo všeobecnosti konzervované v Nidovirales (16), čo naznačuje, že katalyzujú enzymatické reakcie nevyhnutné pre replikáciu nidovírusu.V tejto štúdii sme dokázali, že doména NiRAN koronavírusu prenáša NMP (vygenerovaný z NTP) na nsp9, záhadný proteín viažuci RNA zapojený do replikácie vírusu (26 × 29), aby sme ho určili ako prirodzený cieľ a partnerom koronavírusu RTC.
Doména NiRAN zdieľa tri sekvenčné motívy (AN, BN a CN), ktoré obsahujú veľmi malý počet zvyškov, ktoré sú konzervované vo všetkých rodinách v monofyletickom, ale vysoko diferencovanom poradí Nidovirales (8, 16).Nedávne štúdie ukázali, že štrukturálne súvisia s do značnej miery necharakterizovanou rodinou proteínov podobných proteínkináze, ktoré sa pôvodne nazývali rodina SelO (17, 19, 22, 30, 31).Proteíny súvisiace so SelO majú kinázové záhyby, ale chýba im niekoľko konzervovaných zvyškov aktívneho miesta v klasických kinázach (22, 32).Na základe obrátenej orientácie molekúl ATP naviazaných na aktívne miesto a stabilizovaných špecifickými interakciami sa predpokladalo a následne potvrdilo, že SelO prenáša AMP (namiesto fosfátu) do proteínového substrátu (22), zatiaľ čo iný bakteriálny proteín podobný SelO YdiU má nedávno sa ukázalo, že katalyzujú kovalentné pripojenie UMP na zvyšky Tyr a His rôznych proteínových substrátov (33).
Aby sme potvrdili a rozšírili predikciu predpokladaných zvyškov aktívnych miest koronavírusovej domény NiRAN, použili sme biochemické a reverzné genetické metódy na vykonanie analýzy mutácií na koronavíruse nsp12 (obrázok 3D a príloha E a SI, obrázok S3 a tabuľka) S1â S4).Údaje ukazujú, že nahradenie HCoV-229E K4135, R4178 a D4280 Ala eliminuje in vitro aktivitu NMP transferázy a replikáciu vírusu v bunkovej kultúre (obrázok 3D a prílohy E a SI, obrázok S3), čo podporuje ich prítomnosť v NTP y-fosfáte (K4135, R4178) a koordináciu aktívnych iónov kovov (D4280).Ukázalo sa, že substitúcia E4145A konzervovaného Glu v rozsahu vírusu vtáčieho hniezda, o ktorom sa predpokladá, že stabilizuje polohu K4135 (17), eliminuje replikáciu vírusu, ale prekvapivo sa aktivita zachovala v in vitro teste NMPylácie (obrázok 3D a E a SI príloha, obrázok S3 a tabuľky S1–S4).Podobné pozorovanie sa uskutočnilo, keď sa zaviedla zodpovedajúca substitúcia do homológu YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).Celkovo tieto údaje podporujú skôr regulačnú funkciu tohto konzervovaného zvyšku než katalytickú funkciu.
Nahradenie konzervovaného zvyšku Phe (F4281A) v rozsahu nestovírusu v doméne HCoV-229E NiRAN (8) viedlo k zníženiu NMPylačnej aktivity in vitro a významnému zníženiu replikácie vírusu v bunkovej kultúre (obrázok 3D, E a SI) príloha, obrázok S3).Údaje sú v súlade s dôležitou regulačnou funkciou tohto zvyšku, ako je napríklad homológny zvyšok Phe s motívom DFG uvedený vyššie.V klasických proteínkinázach je súčasťou Mg2+ väzbovej slučky a pomáha zostavovať a regulovať chrbticu???Vyžaduje sa pre účinnú katalytickú aktivitu (32, 34).Nahradením zvyškov Ala a Arg za zvyšky K4116 (v motíve preAN) sa eliminovala replikácia vírusu a podľa očakávania mala in vitro rôzne účinky na aktivitu NMP transferázy v závislosti od zavedeného bočného reťazca aminokyselín (obrázok 3D a prílohy E a SI , obrázok S3).Funkčné údaje sú v súlade so štruktúrnymi informáciami, čo naznačuje, že tento zvyšok vytvoril interakciu s ATP fosfátom (17).V doméne NiRAN iných vnorených rodín vírusov je pozícia HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 obsadená Lys, Arg alebo His (8), čo naznačuje, že funkčné obmedzenie tohto špecifického zvyšku bolo uvoľnené.Substitúcia D4188A a D4283A eliminuje alebo silne znižuje aktivitu enzýmu a eliminuje replikáciu vírusu (obrázok 3).Tieto dva zvyšky sú konzervované vo väčšine (ale nie vo všetkých) vnorených vírusoch (8), čo naznačuje dôležitú rodinne špecifickú, ale možno nekatalytickú funkciu.Ako kontroly sa použili Ala substitúcie niekoľkých ďalších zvyškov Lys a Asp (K4113A, D4180A, D4197A a D4273A), ktoré nie sú konzervované v Coronaviridae alebo iných čeľadiach Nestioviridae (8).Ako sa očakávalo, tieto substitúcie sú do značnej miery tolerovateľné, s miernym poklesom aktivity enzýmu a vírusovej replikácie v niektorých prípadoch (obrázok 3 a príloha SI, obrázok S3).Celkovo sú údaje o mutagenéze koronavírusu veľmi konzistentné s údajmi vlastnej GMP a reverznej genetiky EAV NiRAN-RdRp (16), v ktorých má EAV nsp9 (koronavírus nsp12 ortológ) zvyšok K94 (zodpovedajúci HCoV-229E K4135) dôležité funkcie), R124 (zodpovedajúce R4178), D132 (zodpovedajúce D4188), D165 (zodpovedajúce D4280), F166 (zodpovedajúce F4281).Okrem toho sú údaje o mutagenéze HCoV-229E v súlade s predtým publikovanými údajmi o reverznej genetike SARS-CoV (16) a sú z nich rozšírené, rovnako veľmi podobné tým, ktoré boli pozorované pre zodpovedajúci CN motív Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. opísaný fenotyp -F219A a HCoV-229E_F4281A (obrázok 3 D a E a príloha SI, obrázok S3 a tabuľka S1-S4).
V porovnaní s ortológmi EAV (16), ktoré majú jasnú preferenciu pre UTP a GTP (v samo-NMPylačnej reakcii), naša štúdia ukazuje, že koronavírusová doména NiRAN (reprezentovaná HCoV-229E a SARS-CoV-2) môže byť efektívne prevedené všetky štyri NMP, aj keď sa mierne preferuje UMP (obrázky 1 a 3).Relatívne nízka špecifickosť špecifického ko-substrátu NTP je v súlade s nedávno ohlásenou superkompozitnou štruktúrou SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, v ktorej sa ADP-Mg2+ viaže na aktívne miesto NiRAN, ale nie na adenínovú časť. vzniku špecifických interakcií (17).V našej štúdii typ nukleotidu použitý v NMPylačnej reakcii nemá žiadny rozdielny účinok na aktivitu mutantného proteínu (príloha SI, obrázok S3), čo naznačuje, že žiadny z týchto zvyškov úzko nesúvisí s väzbou špecifickej nukleobázy.Štrukturálny základ a potenciálny biologický význam rôznych preferencií ko-substrátov NTP pozorovaných v doménach NiRAN koronavírusov a arteriálnych vírusov je potrebné študovať;môžu byť pravdivé alebo môžu byť spôsobené obmedzeniami ich príslušných štúdií.V súčasnosti nemožno vylúčiť, že potenciálna aktivita NMPylátora domény NiRAN arteriálneho vírusu (v porovnaní s predtým charakterizovanou aktivitou samo-NMPylácie) má inú preferenciu kosubstrátov, berúc do úvahy, že podobnosť medzi arteriálnym a koronavírusom Doména NiRAN je na hranici svojich možností.Porovnanie založené na sekvencii (16).V porovnaní s pseudokinázou SelO, ktorá používa Mg2+ ako kofaktor, je aktivita koronavírusu a arteriálneho vírusu NiRAN závislá od Mn2+ (16) (obrázok 3C a príloha SI, obrázok S1).Závislosť od Mn2+ a zjavná preferencia pre UTP je nezvyčajnou vlastnosťou proteínových NMPylátorov a bola len nedávno potvrdená v proteíne YdiU Salmonella typhimurium, ktorý katalyzuje striktnú Mn2+-dependentnú proteínovú chaperónovú UMPyláciu na ochranu buniek pred indukciou stresu Bunkový ATP pool ( 33).
Nedávno opísaná štrukturálna podobnosť medzi doménou koronavírusu NiRAN a celulárnymi proteínkinázami (17, 19) poskytuje ďalšiu podporu pre schopnosť NiRAN kovalentne spájať NMP s inými proteínmi, ktoré sme uviedli v tejto štúdii.Naše hľadanie možných cieľov NiRAN sme zamerali na proteíny kódované HCoV-229E ORF1a, o ktorých je známe, že priamo alebo nepriamo pomáhajú RTC replikáze kódovanej ORF1b (12, 35).Naše experimenty poskytujú presvedčivý dôkaz o účinnej a špecifickej NMPylácii nsp9 (obrázok 2).Ak sa cieľový proteín použije v molárnom nadbytku, ktorý je 8 až 10-krát vyšší ako pri enzýme (nsp12), potvrdí sa, že nsp9 je úplne (mono)NMP (obrázok 4).Dospeli sme k záveru, že interakcia medzi nsp12 a nsp9 je krátkodobá a nevytvorí stabilný komplex s nsp9 (v neprítomnosti iných podjednotiek RTC).Tento záver podporujú štúdie interakcií proteínov na proteóme SARS-CoV (35).MS analýza identifikovala primárny amín N-koncového zvyšku nsp9 ako miesto NMPylácie (príloha SI, obrázok S5).Tvorba fosforamidátovej väzby a N-terminálnej aminoskupiny odlišuje NMPylačnú aktivitu sprostredkovanú NiRAN od AMPylačnej reakcie sprostredkovanej Pseudomonas syringae SelO, ktorá katalyzuje tvorbu O-viazaného AMP na zvyškoch Ser, Thr alebo Tyr Peptidový adukt ( 22) a S. typhimurium YdiU tvorí O-viazané (s Tyr) a N-viazané (s His) peptid-UMP adukty.Obmedzené informácie dostupné o rodine proteínov SelO naznačujú, že členovia tejto veľkej rodiny proteínov sa veľmi líšia vo vytváraní aduktov peptid-NMP.Toto je zaujímavé pozorovanie, ktoré si zaslúži ďalšie štúdium.
Údaje získané v tejto štúdii nás viedli k hypotéze, že NMPylácia nsp9 vyžaduje voľný N-koniec.V kontexte vírusovej replikácie to bude zabezpečené proteolytickým štiepením miesta spracovania nsp8|nsp9 v replikázovom polyproteíne pp1a sprostredkované Mpro a pp1ab.Vo väčšine koronavírusov je rozdiel medzi týmto špecifickým miestom (VKLQ|NNEI v HCoV-229E) a všetkými ostatnými miestami štiepenia koronavírusu Mpro Asn (skôr ako ďalší malý zvyšok, ako je Ala, Ser alebo Gly), ktorý zaberá P1â???Miesto (36).Údaje o štiepení peptidu získané v prvých štúdiách ukázali, že účinnosť štiepenia miesta nsp8|nsp9 bola nižšia ako účinnosť iných miest, čo naznačuje, že 1) toto špecifické miesto môže mať regulačnú úlohu pri včasnom koordinovanom spracovaní C-konca. oblasť pp1a alebo 2) a Úloha špeciálneho konzervovaného N-konca nsp9 pri replikácii vírusu (37).Naše údaje (obrázok 5A) ukázali, že rekombinantná forma nsp9 nesúca skutočnú N-koncovú sekvenciu bola účinne NMP nsp12.N-koncová lemujúca sekvencia bola odstránená faktorom Xa (nsp9-His6; SI príloha, tabuľka S1) alebo Mpro-sprostredkovaným štiepením (nsp7-11-His6; obrázok 5A a SI príloha, tabuľka S1).Dôležité je, že nerozrezaný prekurzor nsp7-11-His6 obsahujúci nsp9 vykazoval rezistenciu voči NMPylácii nsp12, čo je v súlade s našimi údajmi, čo naznačuje, že adukt nsp9-NMP sa tvorí prostredníctvom N-terminálneho primárneho amínu (príloha SI, obrázok S5) .Aby sme získali hlbšie pochopenie substrátovej špecifickosti NiRAN, potom sme sa zamerali na susedné N-terminálne zvyšky nsp9.V neprítomnosti iných proteínov sú štrukturálne flexibilné, čo bráni ich detekcii v neznačenej forme nsp9 (26, 28, 38), čo naznačuje ich obmedzenú prirodzenú variáciu. funkcia nsp9 N-koncového fragmentu.Ala substitúcie konzervovaných zvyškov v tejto oblasti (obrázky 5C a D a SI príloha, obrázok S8) ukazujú, že N3826 je nevyhnutný pre nsp9 NMPyláciu in vitro, zatiaľ čo substitúcie N3825A a E3827A vedú k zníženiu NMPylácie, zatiaľ čo substitúcie M3829A a P3830A nie. .Zjavne ovplyvňujú nsp9 NMPyláciu.Hoci substitúcia N-koncového Asn (N3825A, N3825S) má len mierny účinok na nsp9 NMPyláciu a replikáciu vírusu v bunkovej kultúre (obrázok 5C a D), delécia sekvencie zvyšku Asn z N-koncového dipeptidu 3825-NN Ukázalo sa, že je to smrteľné pre vírusy, čo naznačuje, že je potrebný jeden zvyšok Asn pred ďalším zvyškom na N-konci, výhodne Asn, aj keď sa zdá, že substitúcia podobných zvyškov môže byť čiastočne tolerovaná (obrázok 5B, C a D).Dospeli sme k záveru, že dipeptid 3825-NN, najmä konzervovaný a esenciálny zvyšok N3826 v rozsahu koronavírusu (príloha SI, obrázok S6), zaisťuje správnu väzbu a orientáciu N-konca nsp9 v aktívnom mieste NiRAN.
Nahradenie Ala (E3827A) za konzervovaný Glu všetkých podrodín zachováva nsp9 NMPyláciu in vitro, ale je smrteľné pre vírusy v bunkovej kultúre (obrázok 5C a D), čo naznačuje ďalšiu funkciu tohto zvyšku, napríklad v kľúčových interakciách (NMPylované alebo nemodifikované ) nsp9 N-koniec a ďalšie faktory podieľajúce sa na replikácii vírusu.Mutácie Nsp9 neovplyvnili proteolytický proces nsp9 alebo akéhokoľvek susedného nsps (39) (príloha SI, obrázok S9), čo naznačuje, že letálne fenotypy niekoľkých pozorovaných mutácií nsp9 neboli spôsobené dysreguláciou oblasti pp1a terminálu proteolytického procesu C .
Vyššie uvedené údaje poskytujú dôkaz, že po ošetrení štiepneho miesta nsp8|9 v pp1a/pp1ab sprostredkovanom Mpro môže byť N-koniec nsp9 UMPylovaný (alebo čiastočne modifikovaný iným NMP).Okrem toho vynikajúca konzervácia N-konca nsp9 (vrátane singulárnych a invariantných zvyškov Asn v rodine koronavírusov) a údaje o reverznej genetike získané v tejto štúdii (obrázky 3E a 5D) nás viedli k záveru, že opísaná nsp9 NMPylácia je biologicky príbuzný a nevyhnutný pre replikáciu koronavírusu.Funkčné dôsledky tejto modifikácie je potrebné študovať, napríklad pokiaľ ide o skôr opísanú (nešpecifickú) nsp9 (nemodifikovaná forma) väzbovú aktivitu RNA (2628).N-koncová NMPylácia môže tiež ovplyvniť interakciu nsp9 s proteínovými alebo RNA substrátmi alebo tvorbu rôznych štvorúrovňových zostáv.Tieto boli pozorované v štrukturálnych štúdiách a bolo potvrdené, že funkčne súvisia s replikáciou koronavírusu, aj keď najmä v prípade absencie V prípade tejto modifikácie (26- ââ29, 40).
Hoci cieľovú špecifickosť domény NiRAN koronavírusu je ešte potrebné podrobnejšie charakterizovať, naše údaje ukazujú, že cieľová špecifickosť proteínu domény NiRAN koronavírusu je veľmi úzka.Hoci konzervácia kľúčových zvyškov aktívnych miest (8, 16) v doméne NiRAN všetkých rodín nidovírusov silne podporuje aktivitu konzervovaného NMPylatora týchto proteínov, identita zvyškov väzbového vrecka na substrát tejto domény Konzerváciu a konzerváciu treba charakterizovať a môžu sa líšiť medzi rôznymi rodinami účelov Nidovirales.Podobne sa ešte musia určiť relevantné ciele iných vnorených vírusov.Môžu to byť vzdialené ortológy nsp9 alebo iných proteínov, pretože sekvencie mimo piatich replikázových domén, ktoré sú vo všeobecnosti konzervované vo vnorených vírusoch, sú menej konzervované (8), vrátane genómového poľa medzi Mpro a NiRAN, medzi nimi sa nsp9 nachádza v koronavírus.
Okrem toho v súčasnosti nemôžeme vylúčiť možnosť, že doména NiRAN má ďalšie (vrátane bunkových) cieľov.V tomto prípade stojí za zmienku, že bakteriálne homológy v tomto vznikajúcom proteíne NMPylators (NMPylators) (30, 31) majú zrejme „hlavné regulátory“?NMP moduluje rôzne bunkové proteíny, aby reguloval alebo eliminoval ich následné aktivity, čím hrá úlohu v rôznych biologických procesoch, ako je reakcia na bunkový stres a redoxná homeostáza (22, 33).
V tejto štúdii (obrázky 2 a 4 a príloha SI, obrázky S3 a S5) sme dokázali, že nsp12 preniesol časť UMP (NMP) do jednej (konzervovanej) pozície v nsp9, zatiaľ čo iné proteíny neboli v nsp9 modifikované. použité Za týchto podmienok je podporovaná dobre definovaná (skôr ako voľná) substrátová špecifickosť.V súlade s tým je v porovnaní s N-terminálnou nsp9 NMPyláciou vlastná NMPylačná aktivita nsp12 veľmi nízka, jej detekcia si vyžaduje dlhší čas vystavenia autorádiografii a používa sa 10-násobné zvýšenie koncentrácie nsp12.Okrem toho naša analýza MS neposkytla dôkaz o NMPylácii nsp12, čo naznačuje, že samo-NMPylácia domény NiRAN je (v najlepšom prípade) sekundárnou aktivitou.Malo by sa však poznamenať, že iné štúdie poskytli predbežný dôkaz, že stav samo-AMPylácie bakteriálneho NMPylatora môže kontrolovať ich aktivitu NMPylácie na iných proteínových substrátoch (22, 33).Preto je potrebný ďalší výskum na preskúmanie možných funkčných účinkov samo-NMPylačných aktivít hlásených pre EAV nsp9 (16) a koronavírus nsp12 (táto štúdia), vrátane navrhovaného účinku podobného chaperónu na skladanie C-terminálnej RdRp domény ( 16)).
Predtým sa uvažovalo o niekoľkých hypotézach týkajúcich sa možných downstream funkcií nidovírusovej domény NiRAN, vrátane RNA ligázy, RNA-capated guanylát transferázy a proteínovej primárnej aktivity (16), ale žiadna z nich nie je kompatibilná s dostupnými downstream funkciami.Informácie získané na nasledujúcich pozíciách sú presne v rovnakom čase bez ďalších predpokladov.Údaje získané v tejto štúdii sú najviac konzistentné (ale nemôžu dokázať), že doména NiRAN sa podieľa na iniciácii syntézy RNA indukovanej proteínom.Predtým sa verilo, že funkcia domény NiRAN v 5??²-RNA capping alebo RNA ligačné reakcie nie sú ovplyvnené týmito a podporou iných údajov.Preto sa napríklad predpokladá, že aktívne miesto NiRAN zahŕňa konzervovaný Asp ako všeobecnú bázu (D252 v Pseudomonas syringae SelO; D4271 v HCoV-229E pp1ab; D208 v SARS-CoV-2 nsp12) (príloha SI, obrázok 2 ).S2) (17, 22, 33), zatiaľ čo katalýzu v ATP-dependentnej RNA ligáze a RNA capping enzýme vykonáva kovalentný medziprodukt enzýmu-(lyzyl-N)-NMP, ktorý zahŕňa nezmenený zvyšok Lys ( 41).Okrem toho pozoruhodná sekvenčná špecifickosť koronavírusového NiRAN pre konzervované proteínové ciele a uvoľnená špecifickosť pre ko-substráty NTP (preferuje UTP) sú proti funkciám uzatváracieho enzýmu sprostredkovaného NiRAN alebo funkciám podobným RNA ligáze.
Je zrejmé, že je potrebné veľa práce navyše na overenie a ak sa to preukáže, rozpracovanie možnej úlohy nsp9-UMP (nsp9-NMP) v proteínom indukovanej syntéze RNA, ktorá spojí niekoľko zaujímavých, ale (zatiaľ) správ, ktoré už boli publikované .Izolované pozorovania.Napríklad sa zistilo, že koniec negatívneho vlákna RNA koronavírusu začína oligo(U) vláknom (42, 43).Toto pozorovanie je v súlade s myšlienkou, že syntéza RNA s negatívnym reťazcom sa iniciuje naviazaním UMPylovanej formy nsp9 na poly(A) chvost (spúšťače), ktorý môže byť podporovaný jeho väzbou na RNA. Aktivita a/alebo interakcia s ďalší RTC proteín.Časť UMP poskytovaná nsp9 sa potom môže použiť ako „primér“ pre oligouridyláciu sprostredkovanú nsp7/8/nsp12 s použitím 3??²-poly(A) konca v genómovej RNA alebo inej sekvencii obsahujúcej oligo (A). slúži ako templát, podobný mechanizmu stanovenému pre pikornavírusový VPg proteín (44).Čo ak je návrh „nenormatívny“????Začatie syntézy (proteínom indukovanej) negatívneho vlákna RNA poskytuje spojenie s pozorovaniami, čo naznačuje, že RNA negatívneho vlákna koronavírusu má na svojom konci UMP (namiesto UTP), čo sa považuje za dôkaz, že nukleová kyselina Dicer štiepi koniec fosforylovaný neznámou uridín-špecifickou endonukleázou.Ak sa potvrdí, táto hydrolytická aktivita nukleovej kyseliny môže pomôcť uvoľniť oligomérnu UMPylovanú formu nsp9 z 5² konca vznikajúceho negatívneho vlákna.Možná úloha nsp9 pri aktivácii proteínov je tiež v súlade s predchádzajúcimi štúdiami reverznej genetiky, ktoré ukázali, že nsp9 (a nsp8) kriticky a špecificky interaguje s konzervovaným cis-pôsobiacim RNA elementom blízko 3. konca genómu koronavírusu.45).Podľa tejto správy môžu byť tieto predchádzajúce pozorovania teraz znovu preskúmané a rozšírené prostredníctvom ďalšieho výskumu.
V súhrne, naše údaje určili špecifickú aktivitu vlastného vnoreného vírusového enzýmového tagu spojeného s RdRp na N-konci.V koronavíruse sa táto novoobjavená aktivita UMPylator/NMPylator sprostredkovaná NiRAN používa na spoliehanie sa na Mn2+ a priľahlé Asn zvyšky a spôsobuje tvorbu (nízkoenergetických) fosforamidátových väzieb s N-koncovým primárnym amínom.Prostredníctvom Mpro-sprostredkovaného štiepenia v mieste štiepenia nsp8|9 môže byť cieľ nsp9 použitý na NMPyláciu, čo naznačuje funkčné spojenie medzi proteázou a doménou NiRAN, ktoré sa rozširuje na RdRp.Konzervácia kľúčových zvyškov v aktívnom mieste nsp12 NiRAN a cieli nsp9 v kombinácii s údajmi získanými z dvoch koronavírusov vrátane SARS-CoV-2 poskytuje silný dôkaz, že nsp9 NMPylácia je koronavírus. Konzervatívne vlastnosti sú tiež kľúčovým krokom pri replikácii vírusu.Dostupné údaje nás vedú k záveru, že špecifická úloha NMPylovanej formy nsp9 v proteínom indukovanej syntéze RNA je primeraným scenárom pre koronavírusy a iné vnorené vírusy a NiRAN sa môže zamerať aj na iné neidentifikované proteíny.Regulujte vírus.Hostiteľská interakcia.Ak sa potvrdí, zapojenie proteínových primerov do syntézy vírusovej RNA zvýši sekvenčnú afinitu domén Mpro/3CLpro a RdRp medzi predtým zistenou superskupinou koronavírusu a pikornavírusu (9), ktoré sa teraz zjednotili v nedávno zavedených Pisonivirites ( 46) v kategórii.
Naše údaje tiež ukazujú, že základné, selektívne a konzervatívne enzýmové aktivity identifikované v tejto štúdii môžu byť použité ako ciele pre antivírusové lieky.Zo zlúčenín, ktoré interferujú s väzbou (a následnou modifikáciou) konzervovaného N-konca nsp9 v aktívnom mieste NiRAN, sa môžu vyvinúť účinné a všestranné antivírusové lieky, vhodné na liečbu zvieracích a ľudských koronavírusov z rôznych (pod)rodov infekcií vrátane SARS-CoV-2 a koronavírusu s respiračným syndrómom na Blízkom východe.
Kódujúca sekvencia koronavírusového proteínu produkovaného v tejto štúdii bola amplifikovaná pomocou RT-PCR s použitím RNA izolovanej z Huh-7 infikovaného HCoV-229E alebo Vero E6 infikovaného SARS-CoV-2 a vložená pomocou štandardných klonovacích postupov.expresný vektor pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) alebo pASK3-Ub-CHis6 (47) (príloha SI, tabuľky S1 a S2).Substitúcie jednotlivých kodónov boli zavedené miestne cielenou mutagenézou založenou na PCR (48).Na produkciu fúzneho proteínu MBP sa bunky E. coli TB1 transformovali vhodným konštruktom plazmidu pMAL-c2 (príloha SI, tabuľka S1).Fúzny proteín bol purifikovaný amylózovou afinitnou chromatografiou a štiepený faktorom Xa.Následne bol C-koncový His6-značený proteín purifikovaný Ni-imobilizovanou kovovou afinitnou chromatografiou (Ni-IMAC), ako už bolo opísané (49).Na produkciu ubikvitínového fúzneho proteínu bunky E. coli TB1 použili vhodný konštrukt plazmidu pASK3-Ub-CHis6 (príloha SI, tabuľky S1 a S2) a plazmidovú DNA pCGI kódujúcu C-koncovú hydrolázu 1 špecifickú pre ubikvitín (Ubp1).Transformácia (47).C-koncový His6-značený koronavírusový proteín sa purifikoval, ako už bolo opísané (50).
Samo-NMPylačný test HCoV-229E nsp12-His6 sa uskutočnil tak, ako je opísané v EAV nsp9 (16).Stručne povedané, nsp12-His6 (0,5 uM) obsahuje 50 mM kyseliny 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazínetánsulfónovej (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitolu (DTT), 6 mM MnCl2, 25 uM tlmivého roztoku, inkubovať špecifikovaný NTP a 0,17 uM zodpovedajúci [a32-P]NTP (3 000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) pri 30 °C počas 30 minút.Vo všetkých ostatných (štandardných) testoch NMPylácie nsp9 NMPylácie sprostredkovanej nsp12 sa reakčné podmienky upravia nasledovne: nsp12-His6 (0,05 uM) a nsp9-His6 (4 uM) v prítomnosti 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 uM indikovaného NTP a 0,17 uM zodpovedajúceho [a32-P]NTP.Po inkubácii počas 10 minút pri 30 °C sa reakčná vzorka zmiešala so vzorkovým pufrom SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hydroxymetyl)aminometán HCI (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % glycerol a 0,005 % brómfenol Modrá.Proteín sa denaturoval zahrievaním na 90 °C počas 5 minút a separoval sa pomocou 12 % SDS-PAGE.Gél je fixovaný a zafarbený roztokom Coomassie Brilliant Blue (40 % metanol, 10 % kyselina octová, 0,05 % Coomassie Brilliant Blue R-250), odfarbený a vystavený fosforeskujúcej zobrazovacej obrazovke počas 20 hodín (na detekciu nsp12 z NMPylácie) alebo (maximálne) 2 hodiny (na vyhodnotenie nsp9 NMPylácie).Na skenovanie obrazovky sa použil snímač Typhoon 9200 (GE Healthcare) a na analýzu intenzity signálu sa použil ImageJ.
Na MS analýzu sa v NMPylačnej analýze použilo 1 uM nsp12-His6 a 10 uM nsp9 (bez hexahistidínovej značky) (príloha SI, tabuľka S1) a použila sa zvýšená koncentrácia 500 uM UTP a GTP.V závislosti od ich koncentrácie a očakávanej kvality proteínu sa použil systém Waters ACQUITY H-Class HPLC vybavený kolónou MassPrep (Waters) na online odsolenie 1 až 10 ul pufrovaných proteínových roztokov.Odsolený proteín sa eluuje do elektrosprejového iónového zdroja hmotnostného spektrometra Synapt G2Si (Waters) cez nasledujúci gradient pufra A (voda/0,05 % kyselina mravčia) a pufra B (acetonitril/0,045 % kyselina mravčia) a teplota kolóny je 60 °C a prietok 0,1 ml/min: elúcia izokraticky s 5 % A počas 2 minút, potom lineárny gradient na 95 % B počas 8 minút a udržiavanie 95 % B počas ďalších 4 minút.
Detegujú sa kladné ióny s hmotnostným rozsahom 500 až 5000 m/z.Glu-fibrinopeptid B sa meria každých 45 sekúnd na automatickú korekciu posunu hmotnosti.Použite prístrojový softvér MassLynx s rozšírením MaxEnt1 na dekonvolúciu priemerného spektra po odpočítaní základnej línie a vyhladení.
UMPylovaný HCoV-229E nsp9 sa štiepil pridaním modifikovaného trypsínu na úrovni sekvenovania (Serva) a inkuboval sa cez noc pri 37 °C.Na odsolenie a zahustenie peptidov sa použila rotačná kolóna Chromabond C18WP (číslo dielu 730522; Macherey-Nagel).Nakoniec sa peptid rozpustil v 25 ul vody, ktorá obsahovala 5 % acetonitrilu a 0,1 % kyseliny mravčej.
Vzorky sa analyzovali pomocou MS s použitím hmotnostného spektrometra Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Konečný nanoâ HPLC systém (Dionex), vybavený vlastným koncovým 50 cm?75 μm C18 RP kolóna naplnená 2,4 μm magnetickými guľôčkami (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Pripojte sa k hmotnostnému spektrometru online cez zdroj nanosprejov Proxeon;vstreknite 6 ul roztoku na štiepenie trypsínom do 300 um vnútorného priemeru x??1 cm C18 PepMap prekoncentračná kolóna (Thermo Scientific).Použitím vody/0,05 % kyseliny mravčej ako rozpúšťadla bola vzorka automaticky zachytená a odsolená pri prietoku 6 ul/min.
Nasledujúce gradienty voda/0,05 % kyselina mravčia (rozpúšťadlo A) a 80 % acetonitril/0,045 % kyselina mravčia (rozpúšťadlo B) sa použili na dosiahnutie separácie tryptických peptidov pri prietokovej rýchlosti 300 nL/min: 4 % B pre 5 minút, potom 30 A lineárny gradient na 45 % B v priebehu minút a lineárny nárast na 95 % rozpúšťadla B v priebehu 5 minút.Chromatografickú kolónu pripojte k nanoemitoru z nehrdzavejúcej ocele (Proxeon) a nastriekajte eluent priamo do vyhrievanej kapiláry hmotnostného spektrometra pomocou potenciálu 2 300 V. Snímanie prieskumu s rozlíšením 60 000 v hmotnostnom analyzátore Orbitrap je spojené s aspoň tromi dátovými MS/MS skenmi, dynamicky vylúčenými na 30 sekúnd, s použitím lineárnej iónovej pasce vyvolanej disociáciou alebo disociáciou kolízie s vyššou energiou kombinovanej s detekciou orbitrapu, rozlíšenie je 7500.
Čas odoslania: august-03-2021